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產品簡介

16S rDNA是原核生物中編碼核糖體小亞基rRNA的DNA序列,承擔著許多重要的生物學功能。其具有9個高變區域(V1-V9)和10個保守區域,保守區反映細菌種屬間親緣關系,而高變區則反映了物種間的特異性。因此通過分析16S rDNA 可變區的序列即可得到各細菌的分類學特征,結合高通量測序可研究環境或者臨床樣本中的微生物組成及群落功能。

Bacterial 16S rDNA sequencing workflow

Kong HH., Trends in Molecular Medicine. 2011

我們的優勢


1. 更多的Reads數:所測Reads數達100000條,同成本下相較于Miseq,能檢測更多的測序序列和稀有微生物;

2. 更高的數據質量:新一代HiQ,優于Q30級別的完美數據質量,具有更大的反應體系、更長的堿基讀長以及高保真度的堿基識別能力;

3. 更高的檢測靈敏度:均一的覆蓋度,高檢測靈敏度,以及更高的檢測通量,相較于PGM,更多的微生物物種被準確鑒定;

4. 更廣的覆蓋范圍:可覆蓋更廣的可變區,大幅提升后續對序列進行物種注釋時的準確度和靈敏度。



樣本要求

DNA樣品

1. 濃度≥50ng/μL,體積≥60μL;

2. OD260/280介于1.8-2.0之間;

3. 電泳檢測無明顯RNA污染,基因組條帶清晰、完整,無降解;

4. 送樣時請標記清楚樣品編號,管口使用Parafilm膜密封;

5. 樣品保存期間切忌反復凍融;

6. 送樣時請使用干冰運輸。

環境樣本(如土壤、植物根系、海水、腸道等)應詳細描述樣本特征,如土壤:硬度較大,接近石塊、取自河邊,松軟等。

組織樣品提取DNA要注明是內生菌還是外生菌。


實驗流程



1. 客戶樣本:土壤、植物根系、海水、空氣、糞便、唾液等;

2. DNA提取及質控:QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒;

3. 目標區域PCR:引物為16s-V3區、帶有Barcode的特異性引物(338F-518R);

4. 文庫構建:life公司的Ion Plus Fragment Library Kit建庫試劑盒;

5. 上機測序:烈冰推薦life公司的Ion S5測序儀,數據量:30000 reads。



數據分析流程

結果示例

1、物種鑒定
獲得每個OTU(operational taxonomic units)的核心序列之后,與silva 庫(//www.arb-silva.de/)中的 aligned(15S, SSU)核糖體序列進行數據庫比對,得到每一個OTU的物種鑒定情況和豐度。

Krona樣本物種豐度情況

Zamanzadeh M et al., Water Reseqrch. 2016

注:該圖展示了兩個樣本(MD和MD+R)中每個分類群的豐度,每個分類群前的數字代表鑒定為該分類群的reads數占總reads數的百分比



2、微生物群落結構分析
將OTU序列同時與GreenGenes、Silva和RDP等多個數據庫進行比對,并進行reads數目統計,分析不同樣品中的微生物物種差異和豐度變化。

微生物群落結構分析

Garcia-Mena et al., Microb Ecol, 2016

注:該圖展示了正常飲食(SCD)和高脂喂養(HFD)條件下食物過敏與否對消化道微生物群落結構的不同


3、稀釋性曲線分析
從樣本中隨機抽取一定數量的 reads,統計這些 reads 所代表的物種數目。比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度,也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理。

稀釋性曲線分析結果

注:當曲線趨向平坦時,說明測序數據量合理,更多的數據量只會產生少量新的OTU,反之則表明繼續測序還可能產生較多新的 OUT



4、Alpha多樣性分析
Alpha多樣性(樣本內多樣性)是指一個特定區域或者生態系統內的多樣性,常用的度量指標有Chao1 豐富度估計量(Chao1 richness estimator)、香農-威納多樣性指數(Shannon-wiener diversity index)、辛普森多樣性指數(Simpson diversity index)等。計算菌群豐度指標有Chao1和ace;計算菌群多樣性的指標有Shannon和Simpson。

Alpha多樣性

注:該圖展示了不同樣本的Chao1豐富度估計量


5、Beta多樣性分析
Beta多樣性(樣品間差異分析)計算主要反映不同樣本之間的差異度,度量時空尺度上物種組成的變化, 是生物多樣性的重要組成部分, 與許多生態學和進化生物學問題密切相關。beta多樣性計算根據是否考慮OTU的相對豐度,可分為定量指數和定性指數。凡是分析樣品間差異多樣性差異的均屬于beta多樣性分析。

Beta多樣性分析結果

Micha? Kolasa et al., Microbial Ecology. 2019

注:該圖展示了樣本間的差異多樣性



6、LefSe分析
首先在多組樣本中采用的非參數因子Kruskal-Wallis秩和檢驗檢測不同分組間豐度差異顯著的物種(a);然后在上一步中獲得的顯著差異物種,用成組的Wilcoxon秩和檢驗來進行組間差異分析;最后用線性判別分析(LDA)對數據進行降維和評估差異顯著的物種的影響力(即LDA score)。

LefSe分析

Lelouvier et al., Hepatology,2016

注:該圖展示了兩組糞便樣本中差異的微生物群體


7、PICRUSt分析
采用STAMP軟件,可以直接使用來自QIIME的biom文件和PICRUSt的KEGG和ko 文件分析提供精細的功能基因的數量和構成的預測,以及進行樣本間以及組間的差異分析,并給出具有統計意義和置信區間的分析結果。這一分析將我們對于樣本群落的差異進一步深入到了每一類基因的層面,相當于把微生物和功能結合。

PICRUSt分析結果

注:該圖展示了組間的差異KO功能條目



8、物種共富集分析
共富集分析使用CCREPE算法,首先對原始16S rDNA測序數據的種屬數量進行標準化,然后進行秩相關分析并進行統計檢驗,計算出各個物種之間的相關性,之后在所有物種中根據SimScore絕對值的大小,挑選出相關性最高的數據,基于Cytoscap繪制共表達分析網絡圖。

物種共富集分析

Odamaki et al., BMC Microbiology, 2016

注:該圖展示了9個共富集群體的屬間關系。不同顏色圓點表示一個共富集群體,圓點大小表示屬的豐度



高級數據分析

文獻示例

[1] Hussain M, Bonilla-Rosso G, Kwong Chung CKC, et al. High dietary fat intake induces a microbiota signature that promotes food allergy[J]. J Allergy Clin Immunol. 2019 Feb 13. pii: S0091-6749(19)30205-2.


[2] Kolasa M, ?cibior R, Mazur MA, et al. How Hosts Taxonomy, Trophy, and Endosymbionts Shape Microbiome Diversity in Beetles. Microb Ecol. 2019 Mar 27.


[3] Xia X, Zhang P, He L, et al., Effects of tillage managements and maize straw returning on soil microbiome using 16S rDNA sequencing[J]. J Integr Plant Biol. 2019 Mar 26.


[4] Hill C J, Lynch D B, Murphy K, et al. Evolution of gut microbiota composition from birth to 24 weeks in the INFANTMET Cohort[J]. Microbiome, 2017, 5(1):4.


[5] Zamanzadeh M, Hagen L H, Svensson K, et al. Anaerobic digestion of food waste–Effect of recirculation and temperature on performance and microbiology[J]. Water Research, 2016, 96.


[6] Odamaki T, Kato K, Sugahara H, et al. Age-related changes in gut microbiota composition from newborn to centenarian: a cross-sectional study[J]. BMC Microbiology, 2016, 16(1):90.


[7] García-Mena J, Murugesan S, Pérez-Mu?oz AA, et al. Airborne Bacterial Diversity from the Low Atmosphere of Greater Mexico City[J]. Microbial Ecology, 2016, 72(1):70-84.


[8] Lelouvier B, Servant F, Sandrine Pa?ssé, et al. Changes in blood microbiota profiles associated with liver fibrosis in obese patients: A pilot analysis[J]. Hepatology, 2016, 64(6):2015-2027.