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產品簡介

單細胞測序技術(single cell sequencing)是指在單個細胞水平上,對基因組、轉錄組、表觀組進行高通量測序分析的一項新技術,它能夠彌補傳統高通量測序的局限性,揭示單個細胞的基因結構和基因表達狀態,反映細胞間的異質性。2013年,單細胞測序技術被《Science》將其列為年度最值得關注的六大領域榜首;2015年再次登上Science轉化醫學封面。目前,單細胞測序技術在腫瘤、發育生物學、微生物學、神經科學、以及植物學等領域發揮重要作用,正成為生命科學研究的焦點,具有廣闊的應用前景。


單細胞轉錄組測序流程

(https://en.wikipedia.org/wiki/Single_cell_sequencing)

我們的優勢

1. 擁有國際認可的10X Genomics和BD Phrapsody單細胞平臺,實現真正意義上的單細胞測序;

2. 具有豐富的、針對不同樣本類型的單細胞懸液制備經驗,如:外周血、細胞系、新鮮/凍存器官組織、腫瘤組織,確保細胞活性達到測序要求;

3. 擁有成熟的單細胞測序文庫構建技術,一次性完成1000-10000個細胞的文庫構建,真正測全組織中所有細胞類型,做到對樣本中所有類型細胞的全面解析;

4. 具備完善的單細胞測序和實驗質控流程,以及豐富的單細胞測序和數據分析經驗,實現個性化、定制化數據分析服務。



樣本要求

樣本類型:

組織、血液、培養的細胞系、制備好的單細胞懸液

注:若客戶樣本為組織,且無能力進行組織解離來獲取單細胞懸液,烈冰將盡可能提供技術及實驗上的幫助,但因不同類型樣本的特異性,無法保證實驗方法適用于所有類型組織。

質量要求:

1. 細胞活性大于70%

2. 濃度為500-2000細胞/μl

3. 體積不小于200μl

4. 細胞培養基及緩沖液不能含Ca2+和Mg2+

5. 細胞體積小于40μm



實驗流程


1. 單細胞懸液制備:根據樣本特性選擇合適的單細胞懸液制備方法,注意紅細胞裂解;如若客戶樣本為已經制備好單細胞懸液,該步驟可以省略;

2. 細胞活性檢測:細胞活性需大于70%;

3. 單細胞捕獲:通過分選平臺(BD、10X、Drop-seq)對每個細胞進行捕獲;

4. 細胞/轉錄本標簽添加:對結合磁珠標簽的RNA進行逆轉錄引入CB和UMI;

5. 文庫構建:對cDNA進行隨機引物PCR擴增;

6. 上機測序:烈冰推薦Illumina Hiseq或NovaSeq測序平臺,數據量100G/樣本。


數據分析流程


結果示例

1、單細胞懸液制備(附加收費項目)
根據研究目的和對象獲取新鮮的樣本,包括不同類型的腫瘤樣本及其對應的正常樣本。再根據組織樣本的特性,選擇合適的消化條件(酶液、消化溫度和時間),過篩后獲得所需單細胞懸液。

單細胞懸液的制備流程



2、單細胞計數和活性檢測
將細胞從培養液體系更換為上樣緩沖液體系(Sample Buffer),采用Countstar或BD Rhapsody Scanner能夠準確判斷細胞數量以及活性狀態。(注意:當紅細胞/死細胞比例過多時,建議去除此類細胞,保證有效數據量。)

BD Rhapsody Scanner檢測圖

注:活細胞檢測明場圖(左),綠色熒光(中),紅色熒光(右)



3、單細胞捕獲
采用10X Genomics或BD Rhapsody單細胞捕獲平臺,將每個細胞及其mRNA標記上對應的標簽。將收集的帶上磁珠標簽的RNA進行反轉錄,產物可于4℃環境下帶回公司進行后續操作。


圖一:Drop-Seq

哈佛醫學院Steven McCarroll領導的團隊將微流控技術引入單細胞RNA-seq方法中,開發了Drop-seq技術,且該項技術于2015年發表于《Cell》雜志上(Macosko et al., 2015)。Drop-seq技術利用微流體裝置將帶有細胞條形碼的微珠和細胞一起裝入微滴。這些液滴在一個小型設備上生成,沿著一根頭發寬的槽道流動。條形碼附著到每個細胞的一些基因上,因此科學家們可以一次測序所有的基因,追蹤每個基因的來源細胞。


圖二:10X Genomics

2016年,10X Genomics公司首次推出ChromiumTM系統,全面對接Illumina測序儀,能夠自動化完成大規模單細胞研究。10X Genomics單細胞捕獲平臺起源自Drop-Seq技術,通過“雙十字”微流控系統形成一個個含有細胞和凝膠微珠(gel bead)的油包水的乳滴(GEMs),其核心技術在于凝膠微珠表面的引物序列,由標記細胞的Barcode、標記細胞內mRNAUMI和捕獲mRNAPoly dT組成。10X Genomics ChromiumTM系統可實現數千乃至數萬個單細胞的分析,解決常規scRNA-seq在通量或擴展性方面存在的不足。


圖三:BD Rhapsody

BD Rhapsody?單細胞分析系統的誕生基于 BD 在細胞生物學領域 40年的專業技術, 采用CytoSeq特有的蜂窩板技術進行單細胞捕獲。該技術用20W+的微孔(該數量級遠大于Input細胞數量),保證單孔中的單細胞捕獲。同時避免了傳統微流控系統中存在的概率碰撞影響捕獲效率的問題,采用微孔捕獲相對會有更好的捕獲效率,保證Input細胞的全面使用。






4、高通量測序
PCR擴增后開始進行文庫構建,獲得每個樣本的測序文庫。接著采用Illumina Hiseq或NovaSeq高通量測序儀對單細胞轉錄組文庫進行測序,獲得每個樣本的測序數據。

NovaSeq 6000測序儀

5、細胞數量判斷
采用Fastp軟件對下機原始數據進行質控,對質控后測序數據中的cell barcode信息及其對應的counts數進行統計,判斷測序樣本中實際檢測到的細胞數量,獲得樣本的測序細胞數,并根據最終確認的cell barcode信息提取對應的reads。

注:橫坐標為細胞數量,縱坐標為每個細胞對應的平均counts數,根據曲線的斜率判斷實際檢測的細胞數量



6、基因組比對和表達量統計
以cell barcode對應的reads為研究對象,采用STAR算法將測序數據比對到物種對應的基因組上,獲得基因組比對的bam文件。再以bam文件以及基因組注釋文件為研究對象,將比對到同一基因上的UMI進行合并,并去除其中重復的UMI序列,得到每個基因的UMI數量,統計每個細胞中檢測到的基因數以及轉錄本數量,并得到表達量矩陣表。

注:左圖為細胞中總共檢測到的基因數量,右圖為去除重復UMI后統計的基因數量



7、細胞過濾和數據標化
利用基因組比對結果以及表達量結果對測序檢測到的細胞進行過濾,去除細胞中基因檢測數少、線粒體基因占比大的細胞,統計過濾后的細胞數量并得到對應的表達量矩陣表。采用數據標準化方法(CPM/RLE/UQ/TMM/scran/Downsampling等),對不同樣本中細胞基因表達量進行標準化,得到標準化后的表達量矩陣表。

注:橫坐標表示每個細胞中UMI的數量,縱坐標表示線粒體基因的占比情況



8、細胞亞群分析
基于每個細胞中的基因表達量數據,采用聚類算法對細胞進行亞群分析,同時采用t-SNE分析對細胞的分群結果進行可視化展示。同時,還可以對不同樣本中各細胞亞群的占比情況進行統計分析。

Azizi E et al., Cell. 2018

注:上圖為乳腺癌腫瘤組織、正常組織、血液和淋巴結樣本中免疫細胞亞群鑒定;下圖為不同組織樣本中各細胞亞群的占比情況



9、Marker基因鑒定
鑒定不同細胞亞群中的Marker基因,并對Marker基因的表達分布進行可視化展示。

Dick S A et al., Nature immunology. 2019

注: marker基因的Feature Plot圖(上)和Violin圖(下)



10、差異基因篩選
針對所有或者特定細胞亞群,進行細胞亞群間差異表達基因篩選,獲得細胞亞群間差異表達基因。

Dick S A et al., Nature immunology. 2019

注:該圖為不同細胞亞群間差異基因聚類分析圖(Heatmap)



11、功能分析(GO Analysis)和信號通路分析(Pathway Analysis)
分別采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO數據庫,以及KEGG數據庫,對Marker基因/差異基因進行功能分析和信號通路分析,從而得到這些基因群體所顯著性富集的GO條目和Pathway條目。

Dick S A et al., Nature immunology. 2019

注:該圖為不同cluster之間差異基因顯著富集的Pathway條目



高級數據分析
1、RNA velocity分析
采用velocyto算法,預測單個細胞的變化方向,得到細胞間的轉變過程。

Manno G L et al., Nature, 2018

注:該圖為RNA velocity分析結果圖,圖中箭頭方向代表算法預測的細胞演化方向



2、Pesudotime分析
以細胞的表達量數據為研究對象,采用TSCAN/monocle/SLICER/Ouija等算法,在虛擬時間軸上對細胞的變化模式進行分析,模擬重建細胞的動態變化過程,獲得細胞間的狀態轉換關系,以及不同狀態細胞間差異基因的表達情況。

Dick S A et al., Nature immunology. 2019

注:細胞間狀態轉換的pesudotime軌跡圖(右)和Heatmap圖(左)



3、細胞間通訊分析
以細胞亞群的基因表達量數據為研究對象,獲得細胞中的配體及受體基因的表達信息,得到細胞亞群間的信號通訊關系。

Vento-Tormo R et al., Nature. 2018

注:橫坐標表示細胞類型,縱坐標表示細胞間通訊關系,圓圈大小表示顯著性差異水平,圓圈顏色越紅表示細胞間通訊關系越強



4、TCGA預后聯合分析
以TCGA臨床信息以及篩選到的關鍵基因為研究對象,結合TCGA臨床數據,進行預后分析,獲得該基因/基因集與臨床預后之間的關系。

Guo X, et al. Nature Medicine, 2018

注:橫坐標表示生存期,縱坐標表示占比,不同顏色曲線代表不同分組



文獻示例

[1] Mickelsen LE, Bolisetty M, Chimileski BR, et al. Single-cell transcriptomic analysis of the lateral hypothalamic area reveals molecularly distinct populations of inhibitory and excitatory neurons[J]. Nat Neurosci. 2019 Apr;22(4):642-656.(IF=19.912)


[2] Pijuan-Sala B, Griffiths JA, Guibentif C, et al. A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis[J]. Nature. 2019 Feb;566(7745):490-495.(IF=41.577)


[3] Cao J, Spielmann M, Qiu X, et al. The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis[J]. Nature. 2019 Feb;566(7745):496-502.(IF=41.577)


[4] Tiklová K, Bj?rklund ?K, Lahti L, et al. Single-cell RNA sequencing reveals midbrain dopamine neuron diversity emerging during mouse brain development[J]. Nat Commun. 2019 Feb 4;10(1):581.(IF=12.353)


[5] Bartoschek M, Oskolkov N, Bocci M, et al. Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single cell RNA sequencing[J]. Nat Commun. 2018 Dec 4;9(1):5150.(IF=12.353)


[6] Guo X, Zhang Y, Zheng L, et al. Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single-cell sequencing[J]. Nature Medicine. 2018 Jul;24(7):978-985.(IF=32.621)


[7] Azizi E, Carr AJ, Plitas G, et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment[J]. Cell. 2018 Aug 23;174(5):1293-1308.e36.(IF=31.398)


[8] Fujii M, Matano M, Toshimitsu K,et al. Human Intestinal Organoids Maintain Self-Renewal Capacity and Cellular Diversity in Niche-Inspired Culture Condition[J]. Cell Stem Cell. 2018 Dec 6;23(6):787-793.e6.(IF=23.29)


[9] Dick SA, Macklin JA, Nejat S, et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction[J]. Nat Immunol. 2019 Jan;20(1):29-39.(IF=21.809)


[10] Kumar M P, Du J, Lagoudas G, et al. Analysis of Single-Cell RNA-Seq Identifies Cell-Cell Communication Associated with Tumor Characteristics[J]. Cell Reports. 2018 Nov 6;25(6):1458-1468.e4.(IF=8.032)