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產品簡介

DNA甲基化(DNA methylation)是基因調控的手段之一,在維持細胞正常功能、傳遞基因組印記、胚胎發育、腫瘤發生等方面起著至關重要的作用,更是表觀遺傳學研究的熱點。全基因組甲基化測序(Whole Genome Bisulfite Sequencing,WGBS)作為甲基化測序的“金標準”,對有參考基因組的物種在全基因組水平進行全面、高效、高準確度的甲基化研究,從而構建單堿基分辨率的全基因組DNA甲基化水平圖譜。

哺乳動物DNA甲基化主要為CG型,而富含CpG二核苷酸的CpG島常位于轉錄調控區附近,與56%的人類基因組編碼基因相關。上海烈冰與Agilent公司聯手推出的CpG島精準甲基化測序,采用SureSelect系統進行靶標富集,全面覆蓋基因組中最具表觀遺傳學研究意義的區域,極大提高測序數據有效性,達到單堿基分辨率,同時降低成本,縮短測序時長,實現多樣本實驗。


A workflow for Bisulfite Sequencing

我們的優勢

1. 精準覆蓋:采用SureSelect靶標富集系統,可覆蓋370萬CpG,包括CpG島、GENCODE啟動子、癌癥以及組織特異性DMR等,對具有生物學意義的甲基化位點實現全面覆蓋;

2. 高深度:只需10Gb數據可達100×覆蓋深度,是普通測序深度的3倍,極大提高了對低頻甲基化位點的探測率;

3. 高靈敏度:采用Bisulfite轉化前捕獲,對甲基化和非甲基化均等捕獲;單堿基分辨率,可精準檢測每個胞嘧啶的甲基化狀態;

4. 低成本、高效率:使用液體捕獲技術,大大提高捕獲效率;同時靶標區域的選擇策略可降低成本,得以實現多樣本快速實驗;

樣本要求

組織樣品≥50mg

DNA樣品

1. 請提供總量≥3μg/樣本,濃度≥100ng/μL的DNA;

2. OD260/280介于1.8-2.0之間;

3. 電泳檢測無明顯RNA污染,基因組條帶清晰、完整,無降解;

4. 送樣時請標記清楚樣品編號,管口使用Parafilm膜密封;

5. 樣品保存期間切忌反復凍融;

6. 送樣時請使用干冰運輸。

注:不同樣品之間存在差異,詳情請向烈冰咨詢

實驗流程


1. DNA提取及質控:凝膠電泳質控→Nanodrop質控→Agilent 2200質控;

2. DNA超聲片段化:片段化后,末端修復加A,并連接甲基化接頭;

3. SureSelect靶向捕獲:單鏈RNA探針雜交進行液相捕獲;

4. Bisulfite轉化:靶向捕獲之后進行BS轉化,降低甲基化偏好性和DNA損傷;

5. 加接頭擴增:捕獲之后進行PCR擴增文庫構建,降低PCR偏好性;

6. 上機測序:烈冰建議選擇NovaSeq,雙端測序,通量大,堿基精度高,而且成本低,速度快。數據量:10G。

數據分析流程

結果示例

1、原始數據質量控制
針對過短序列,污染序列,尾端低質量序列,進行下機原始數據(Raw Data)的過濾,并采用Fastp對于過濾前后的數據進行質控,得到堿基質量,GC含量,長度分布等分析結果。圖1部分展示Raw Data的質量控制結果。

堿基質量結果圖

注:左圖橫坐標代表堿基位點,縱坐標代表堿基質量值,不同顏色曲線代表不同堿基在每條read上的質量值;右圖橫坐標代表堿基位點,縱坐標代表堿基含量比值,不同顏色曲線代表不同位點各堿基含量。



2、序列比對(DNA Mapping)
采用Bismark等軟件將過濾后的數據鏈特異性地比對到參考基因組上,得到5mC的甲基化類型、狀態、比例,用于后續甲基化水平、分布及差異甲基化分析。采用Samtools工具,對于基因組比對文件,進行排序并建立索引。

比對流程

注:該圖為Bismark比對原理圖


3、甲基化水平及分析
采用Bismark算法對5mC鑒定分析結果進行甲基化類型、水平和分布的分析,得到在不同樣本中的甲基化類型、水平及其基因組上的分布情況。

CpG位點在基因組上的分布

Li J et al., Genome Research. 2019

注:該圖對比了GPSWGBS檢測出的CpG位點在基因組上的分布情況



4、樣本相關性、聚類、PCA分析
以每一個樣本的5mC鑒定分析結果為研究對象,采用PCA降維算法,Pearson相關性系數,K-Mean聚類等多種算法,對于每一個甲基化測序樣本的甲基化程度以及樣本相關性進行描述,得到樣本的關聯結果。

多樣本間甲基化相關性分析

Wan et al., Sci Rep. 2016

注:該圖展示了羅非魚骨骼肌雌雄兩性間CpG甲基化的Pearson相關性


5、差異甲基化區域(DMR)篩選
以每一個樣本的5mC鑒定分析結果為研究對象,采用Methykit算法,對于差異甲基化區域進行分析,得到不同樣本間差異的甲基化區域。

CIRCOS:差異甲基化區域

Yizan Ma et al., Plant Cell. 2018

注:通過繪制可視化Circos圖,展示了常溫(NT)和高溫(HT)處理對不同品系棉花(84021和H05)花藥不同時期DMR在染色體上的分布情況



6、DMS/DMR相關基因分析
依據DMR注釋獲取DMR相關的基因群,然后針對該基因群進行相關基因群的GO、KEGG Pathway和PPI分析。

DMR相關基因群PPI分析

注:基于DMS/DMR注釋基因的GO條目和Pathway條目,我們可以根據其上下級調控關系繪制GO-Tree和Pathway-Act-Network,并基于STRING數據庫進行PPI分析



高級數據分析
1、差異甲基化區域(DMR)注釋
采用ChipSeeker算法,對于差異甲基化區域進行注釋分析,得到DMR對應的基因以及所在的基因結構,包括啟動子、外顯子、內含子、基因間區等。

不同樣本CG-DMR的基因組分布

Rizzardi LF et al., Nat Neurosci. 2019

注:該圖通過聚類分析展示了不同Cell typeneuronal中的CG-DMR在基因組結構上的分布情況



文獻示例

[1] Ai T, et al. DNA methylation profile is associated with the osteogenic potential of three distinct human odontogenic stem cells. Signal Transduct Target Ther. 2018. Jan 12;3:1.


[2] Liu H, et al. Integrative analysis of DNA methylation, mRNAs, and small RNAs during maize embryo dedifferentiation. BMC Plant Biol. 2017 Jun 15;17(1):105.


[3] Fang X, et al. Comparative genome-wide methylation analysis of longissimus dorsi muscles between Japanese black (Wagyu) and Chinese Red Steppes cattle. PloS One. 2017 Aug 3;12(8):e0182492.


[4] Wang Z, et al. Decreased Methylation Level of H3K27me3 Increases Seizure Susceptibility. Mol Neurobiol. 2017 Nov;54(9):7343-7352.


[5] Cheng J, et al. SUMOylation of MeCP2 is essential for transcriptional repression and hippocampal synapse development. J Neurochem. 2014 Mar;128(6):798-806.