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產品簡介

全轉錄組是指特定細胞在特定狀態下所能轉錄出來的所有RNA的總和,包括mRNA和非編碼RNA(non-coding RNA)。針對非編碼RNA的研究主要集中在具有調控作用的miRNA,lncRNA和circRNA?;詼廡蚣際醯娜甲椴廡蜓芯?,同時分析同一樣本中的mRNA,lncRNA,circRNA,miRNA,并且通過兩兩關聯分析、三元關聯分析、多元關聯分析,使研究內容更加系統化,致力于深入挖掘生命現象背后的轉錄調控問題。



ceRNA(競爭性內源RNA)機制示意圖

Wang Y et al., Trends Genet, 2016

我們的優勢

1. 雙文庫構建:small RNA文庫和去核糖體的鏈特異性文庫,烈冰 8年建庫經驗,保證建庫質量;

2. 4種RNA全方位分析:不僅能定量分析已知的lncRNA和miRNA,還能通過Stringtie重建轉錄本預測新的lncRNA;并通過預測的circRNA進行靶向分析 ,從而得到miRNA-mRNA、lncRNA-miRNA、以及circRNA-miRNA的靶向關系;

3. 數據庫全面整合:整合并定時升級國際公認數據庫和靶基因預測算法,如NP Inter、miRBase、RNAhybrid等,保證分析結果緊跟國際最前沿;

4. 上游測序+下游驗證:客戶只需提供細胞,組織或者總RNA,烈冰為您完成從上機測序到數據分析整套服務流程,同時可進行后續qPCR驗證。



樣本要求

組織樣品:

1. 動物組織≥1g;

2. 植物組織≥2g;

3. 細胞樣品≥1×106個;

4. 全血≥5mL;

5. 菌體≥106個或≥30mg。

RNA樣品:

1. 樣品需求量: RNA≥10 μg;

2. 樣品濃度:RNA樣品≥100 ng/μl;

3. 樣品純度:OD260/OD280在1.8-2.2之間,OD260/OD230≥2,28S/18S≥1,動物樣品RIN≥7.0,植物樣品RIN≥6.5,RNA無明顯降解。


實驗流程


1. 客戶樣本:細胞量在106以上;

2. RNA提取及質控:凝膠電泳質控→Nanodrop質控→Agilent 2200質控;

3. small RNA文庫構建:切膠范圍10-50bp,單端測序SE50,文庫分子18-30bp;

4. 去核糖體文庫構建:逆轉錄后用RNase處理,去除rRNA;

5. 上機測序:烈冰建議選擇NovaSeq,雙端測序,通量大,堿基精度高,而且成本低,速度快。



數據分析流程

結果示例

1、mRNA數據分析結果展示詳見“轉錄組測序”

2、miRNA數據分析結果展示詳見“small RNA測序”

3、LncRNA鑒定和差異lncRNA分析
以RNA mapping得到的counts為研究對象,采用NCBI Gene/Ensembl Biomart/NONCODE等數據庫的Genetype注釋信息,對已知的lncRNA/假基因/其它長鏈非編碼RNA進行鑒定。隨后,以這些lncRNAs 的counts為研究對象,采用DESeq2/DESeq/EBSeq/EdgeR/Limma等算法進行差異篩選,得到滿足差異倍數以及FDR閾值的差異基因(Dif-lncRNA)。并基于差異篩選結果,進行火山圖以及聚類分析,得到Volcano Plot和Cluster Heatmap。

差異lncRNAs火山圖分析和聚類分析

Yang F et al., Gene, 2016

注:(A)差異lncRNA火山圖分析結果,紅色表示顯著差異的lncRNA,藍色表示非顯著差異的lncRNA;(B)差異lncRNA聚類分析的Heat map,紅色越深表示lncRNA上調越顯著,藍色越深表示lncRNA下調越顯著。



4、lncRNA靶向分析
以差異lncRNAs、差異miRNAs為研究對象,采用miranda算法和RNAHybrid算法進行靶基因預測,得到lncRNA-miRNA靶向作用關系。

lncRNA-miRNA靶向作用關系

Miao X et al., Sci Rep, 2016

注:紅色三角表示上調lncRNAs,綠色三角表示下調lncRNAs,紫色V型三角表示上調miRNAs,藍色V型三角表示下調miRNAs。



5、ceRNA分析
以lncRNA-miRNA靶向關系為研究對象,再聯合miRNA靶向基因的信息,采用負相關分析方法,得到lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA關系,并繪制lncRNA-miRNA-mRNA Network。

lncRNA-miRNA-mRNA Network

Miao X et al., Sci Rep, 2016

注:紫色三角形表示lncRNA,紅色圓點表示mRNA,黃色圓點表示關鍵mRNA,藍色V型三角表示miRNA。



6、ceRNA基因功能分析(GO Analysis)和信號通路分析(Pathway Analysis)
以ceRNA為研究對象,分別采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO數據庫,以及KEGG數據庫,對差異基因進行功能分析和信號通路分析,從而得到ceRNA基因所顯著富集的功能條目和pathway條目。

差異基因GO分析和Pathway分析

Xu T et al., Oncogene. 2015

注:(a)lncRNA TINCR-siRNA VS scrambled siRNA差異基因聚類分析圖;(b)差異基因顯著富集的pathway條目;(c)差異基因顯著富集的GO條目。



7、circRNA預測
環狀RNA(circRNA)是區別于傳統線性RNA的一類新型RNA,具有閉合環狀結構。我們根據circRNA在表達過程中的特殊剪接形式,采用circexplorer/CIRI/ACFS/find_circ等算法,對測序得到的reads進行circRNA預測,可以發現同時覆蓋兩個外顯子且方向與線性RNA相反的circRNA,以及一些Intergenic或者Intron區域來源的新的circRNA。

circRNA預測工作流和預測結果(正常組織 VS 癌組織)

Chen W et al., Nat Neurosci. 2015/Zheng Q et al., Nature Communications, 2016

注:(a)橫坐標表示circRNA反向剪接reads數,縱坐標表示circRNA數量;(b)circRNA在基因組結構上的分布;(c)橫坐標表示exonic circRNA長度,縱坐標表示circRNA數量。



8、差異circRNA分析
以預測的circRNA為研究對象,采用DESeq2/DESeq/EBSeq/EdgeR/Limma等算法進行差異篩選,得到滿足差異倍數(Log2FC>1或<-1)以及FDR閾值(FDR<0.05)的差異circRNA(Dif-circRNA)。

差異circRNA分析結果

Liu Q et al., Scientific Reports, 2016

注:左圖為差異circRNA的聚類分析圖(OA VS normal軟骨組織);右圖為差異circRNA的火山圖,紅點表示差異顯著的circRNA。


9、circRNA靶向分析
以差異circRNA為研究對象,采用miranda算法與RNAHybrid算法進行靶向調控關系預測,得到miRNA與差異circRNA靶向調控關系。

circRNA-miRNA相互作用

Zheng Q et al., Nature Communications, 2016

注:該圖展示了circHIPK3相互作用的miRNAs的假定結合位點。



10、ceRNA分析
以circRNA-miRNA靶向關系為研究對象,再聯合miRNA靶向基因的信息,采用負相關分析方法,得到circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA關系,并繪制circRNA-miRNA-mRNA Network。

circRNA-miRNA-mRNA Network

Liu Q et al., Scientific Reports, 2016

注:綠色圓點表示circRNA,黃色菱形表示mRNA,紫色V型三角表示miRNA。


11、WGCNA功能預測
加權基因共表達網絡(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA)是一個基于基因表達數據,構建基因共表達網絡的方法。NovelBio團隊協助研究者利用WGCNA進行功能預測,根據基因表達模式,將基因進行分組。根據“凡是能夠互相形成共表達關系并且成簇的基因,具有類似的功能”,可以認為circRNA和它所屬簇中mRNA具有類似的功能,并且可以通過mRNA所富集功能和信號通路對circRNA對于表型的影響進行預測。

circRNA和蛋白編碼基因的WGCNA分析

Wang Z  et al. Frontiers in plant science, 2017

注:該圖為WGCNA計算出來的不同module,與不同表型相關性高的module,并對moudle16以及兩個circRNA的關系網絡圖分別進行了可視化展示。


高級數據分析
1、 韋恩分析(Venn Analysis)
以實驗中需解決的科學問題為研究目標,以每兩組間的差異mRNA,lncRNA,circRNA、miRNA為研究對象,采用韋恩分析方法,得到每兩組中獨有或共有的mRNA、lncRNA,circRNA、miRNA。


E50 VS E40E60 VS E50差異mRNA/lncRNA韋恩圖

Li Y et al., BioMed Research International. 2019

注:左圖為E50 VS E40差異mRNAE60 VS E50差異mRNA的韋恩分析結果;右圖為E50 VS E40差異lncRNAE60 VS E50差異lncRNA的韋恩分析結果。



2、 lncRNA/circRNA基因富集分析
為了從龐雜的組學數據中發掘規律,研究lncRNA/circRNA的生物功能,NovelBio團隊為研究者定制基因富集分析(Gene set enrichment analysis, GSEA),找到起關鍵作用的生物通路,進一步確定研究的lncRNA/circRNA與表型相關的生物學機制。

干預LncRNA GAS5的基因富集分析

Liu et al., Nat Commun, 2016

注:該圖為LncRNA GAS5過表達和敲低后,hESCs的基因富集分析結果。其中,ES表示富集度得分,NES表示ES標化后的值,得分越高表示該基因類別與該干預呈正相關。



文獻示例

[1] Lei B, Zhou J, Xuan X, et al. Circular RNA expression profiles of peripheral blood mononuclear cells in hepatocellular carcinoma patients by sequence analysis. Cancer Med. 2019 Feb 4. (IF=3.202)


[2] Li Y, Li GQ, Wang F, et al. Integrated Analysis of LncRNA-mRNA Coexpression in the Extracellular Matrix of Developing Deciduous Teeth in Miniature Pigs. BioMed Research International. 2019 Jan 23. (IF=2.583)


[3] Yu Y, Zhang M, Liu J, et al. Long Non-coding RNA PVT1 Promotes Cell Proliferation and Migration by Silencing ANGPTL4 Expression in Cholangiocarcinoma. Mol Ther Nucleic Acids. 2018 Dec 7;13:503-513. (IF=5.66)


[4] Qu S, Hao X, Song W, et al. Circular RNA circRHOT1 is upregulated and promotes cell proliferation and invasion in pancreatic cancer. Epigenomics. 2018 Nov 16;11(1):53-63. (IF=4.979)


[5] Yu Y, Zhang M, Wang N, et al. Epigenetic silencing of tumor suppressor gene CDKN1A by oncogenic long non-coding RNA SNHG1 in cholangiocarcinoma. Cell Death Dis. 2018 Jul 3; 9(7):746-758. (IF=5.638)


[6] Yin D, Lu X, Su J, et al. Long noncoding RNA AFAP1-AS1 predicts a poor prognosis and regulates non-small cell lung cancer cell proliferation by epigenetically repressing p21 expression. Mol Cancer. 2018 May 24;17(1):92. (IF=7.776)


[7] Liang Ding,et al. A novel stromal lncRNA signature reprograms fibroblasts to promote the growth of oral squamous cell carcinoma via LncRNA-CAF/interleukin-33. Carcinogenesis. 2018 Mar 8;39(3):397-406. (IF=5.105)


[8] Sun D,et al.LncRNA GAS5 inhibits microglial M2 polarization and exacerbates demyelination. EMBO Rep. 2017 Oct;18(10):1801-1816. (IF=8.568)


[9] Lai, Z.Y. et al. Analysis of co-expression networks for circular RNAs and mRNAs reveals that circular RNAs hsa_circ_0047905, hsa_circ_0138960 and hascircRNA7690-15 are candidate oncogenes in gastric cancer. Cell Cycle. 2017 Oct 5:1-11. (IF=3.53)


[10] Zhang E, et al. H3K27 acetylation activated-long non-coding RNA CCAT1 affects cell proliferation and migration by regulating SPRY4 and HOXB13 expression in esophageal squamous cell carcinoma. Nucleic Acids Res.  2017 Apr 7;45(6):3086-3101.. (IF=10.162)


[11] Xu C, et al. Long non-coding rna gas5 control human embryonic stem cell self renewal by maintaining nodal signaling. Nat Commun. 2016 Nov 4;7:13287. (IF=12.124)


[12] Zheng Q, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016 Apr 6;7:11215. (IF=11.47)


[13] Liu Q, et al. Circular RNA Related to the Chondrocyte ECM Regulates MMP13 Expression by Functioning as a MiR-136 ‘Sponge’ in Human Cartilage Degradation. Sci Rep. 2016 Mar 2;6:22572. (IF=5.578)