服務熱線400-065-1811
當前位置:斗破苍穹之唯我独尊 > 單細胞測序

什么是單細胞測序

單細胞測序技術(single cell sequencing)是指在單個細胞水平上,對基因組、轉錄組、表觀組進行高通量測序分析的一項新技術,它能夠彌補傳統高通量測序的局限性,揭示單個細胞的基因結構和基因表達狀態,反映細胞間的異質性。2013年,單細胞測序技術被《Science》將其列為年度最值得關注的六大領域榜首;2015年再次登上Science轉化醫學封面。目前,單細胞測序技術在腫瘤、發育生物學、微生物學、神經科學、以及植物學等領域發揮重要作用。 正成為生命科學研究的焦點。具有廣闊的應用前景。

烈冰單細胞測序優勢

烈冰單細胞測序為了準確快速地進行單細胞測序研究,基于最前沿的研究文獻進行多重優化,真正做到最準確可靠全面的單細胞測序解析

  • 10X Genomics
  • BD Rhapsody
  • Drop-Seq
  • BD FACSMelody

2016年,10X Genomics公司首次推出ChromiumTM系統,全面對接Illumina測序儀,能夠自動化完成大規模單細胞研究。10X Genomics單細胞捕獲平臺起源自Drop-Seq技術,通過"雙十字"微流控系統形成一個個含有細胞和凝膠微珠(gel bead)的油包水的乳滴(GEMs),其核心技術在于凝膠微珠表面的引物序列,由標記細胞的Barcode、標記細胞內mRNA的UMI和捕獲mRNA的Poly dT組成。10X Genomics ChromiumTM系統可實現數千乃至數萬個單細胞的分析,解決常規scRNA-seq在通量或擴展性方面存在的不足。

BD Rhapsody?單細胞分析系統的誕生基于 BD 在細胞生物學領域 40年的專業技術, 采用CytoSeq特有的蜂窩板技術進行單細胞捕獲。該技術用20W+的微孔(該數量級遠大于Input細胞數量),保證單孔中的單細胞捕獲。同時避免了傳統微流控系統中存在的概率碰撞影響捕獲效率的問題,采用微孔捕獲相對會有更好的捕獲效率,保證Input細胞的全面使用。

哈佛醫學院Steven McCarroll領導的團隊將微流控技術引入單細胞RNA-seq方法中,開發了Drop-seq技術,且該項技術于2015年發表于《Cell》雜志上(Macosko et al., 2015)。Drop-seq技術利用微流體裝置將帶有細胞條形碼的微珠和細胞一起裝入微滴。這些液滴在一個小型設備上生成,沿著一根頭發寬的槽道流動。條形碼附著到每個細胞的一些基因上,因此科學家們可以一次測序所有的基因,追蹤每個基因的來源細胞。

BD FACSMelody?細胞分選儀結合BD高端分選儀專利技術與智能自動化軟件,將簡便易用的分選儀推向一個新高度。便捷的操作可幫助節約儀器調試的時間,并且提供質量可重復的檢測結果。BD FACSMelody?細胞分選儀讓更多的研究者可以使用復雜的流式細胞儀和分選技術獲得更想要的細胞,提高實驗室效率。

樣本要求

樣本類型

組織、血液、培養的細胞系、制備好的單細胞懸液
注:若客戶樣本為組織,且尚未成功將組織樣本消化成單細胞懸液,烈冰將盡可能提供技術及實驗上的幫助,但因不同類型樣本的特異性,無法保證實驗方法適用于所有類型組織。

質量要求

細胞活性大于70%,濃度為500-2000細胞/μl,
體積不小于200μl,細胞培養基及緩沖液不能含Ca2+和Mg2+,細胞體積小于40μm。


實驗流程

01
客戶樣本

02
細胞計數及活性
檢測

03
單細胞捕獲

04
細胞/轉錄本
標簽添加

05
文庫構建

06
上機測序

結果示例

細胞數量判斷

采用Fastp軟件對下機原始數據進行質控,對質控后測序數據中的cell barcode信息及其對應的counts數進行統計,判斷測序樣本中實際檢測到的細胞數量,獲得樣本的測序細胞數,并根據最終確認的cell barcode信息提取對應的reads。

注:橫坐 標為細胞數量,縱坐標為每個細胞對應的平均 counts 數,根據曲線的斜率判斷實際檢測的細胞數量

基因組比對和表達量統計

以cell barcode對應的reads為研究對象,采用STAR算法將測序數據比對到物種對應的基因組上,獲得基因組比對的bam文件。再以bam文件以及基因組注釋文件為研究對象,將比對到同一基因上的UMI進行合并,并去除其中重復的UMI序列,得到每個基因的UMI數量,統計每個細胞中檢測到的基因數以及轉錄本數量,并得到表達量矩陣表。

注:左圖為細胞中總共檢測到的基因數量,右圖為去除重復 UMI 后統計

細胞過濾和數據標化

利用基因組比對結果以及表達量結果對測序檢測到的細胞進行過濾,去除細胞中基因檢測數少、線粒體基因占比大的細胞,統計過濾后的細胞數量并得到對應的表達量矩陣表。采用數據標準化方法(CPM/RLE/UQ/TMM/scran/Downsampling等),對不同樣本中細胞基因表達量進行標準化,得到標準化后的表達量矩陣表。

注:橫坐標表示每個細胞中UMI的數量,縱坐標表示線粒體基因的占比情況

細胞亞群分析

基于每個細胞中的基因表達量數據,采用聚類算法對細胞進行亞群分析,同時采用 t-SNE 分析對細胞的分群結果進行可視化展示。同時,還可以對不同樣本中各細胞亞群的占比情況進行統計分析。

注:上圖為乳腺癌腫瘤組織、正常組織、血液和淋巴結樣本中免疫細胞亞群鑒定;下圖為不同組織樣本中各細胞亞群的占比情況

Marker基因鑒定

鑒定不同細胞亞群中的Marker基因,并對Marker基因的表達分布進行可視化展示。

注: marker基因的Feature Plot圖(上)和Violin圖(下)

差異基因篩選

針對所有或者特定細胞亞群,進行細胞亞群間差異表達基因篩選,獲得細胞亞群間差異表達基因。

注:該圖為不同細胞亞群間差異基因聚類分析圖(Heatmap)

功能分析(GO Analysis)和信號通路分析(Pathway Analysis)

分別采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO數據庫,以及KEGG數據庫,對Marker基因/差異基因進行功能分析和信號通路分析,從而得到這些基因群體所顯著性富集的GO條目和Pathway條目。

注:該圖為不同cluster之間差異基因顯著富集的Pathway條目

高級數據分析

RNA velocity分析

采用velocyto算法,預測單個細胞的變化方向,得到細胞間的轉變過程。

注:該圖為RNA velocity分析結果圖,圖中箭頭方向代表算法預測的細胞演化方向

Pesudotime分析

以細胞的表達量數據為研究對象,采用TSCAN/monocle/SLICER/Ouija等算法,在虛擬時間軸上對細胞的變化模式進行分析,模擬重建細胞的動態變化過程,獲得細胞間的狀態轉換關系,以及不同狀態細胞間差異基因的表達情況。

注:細胞間狀態轉換的pesudotime軌跡圖(上)和Heatmap圖(下)

細胞間通訊分析

以細胞亞群的基因表達量數據為研究對象,獲得細胞中的配體及受體基因的表達信息,得到細胞亞群間的信號通訊關系。

注:橫坐標表示細胞類型,縱坐標表示細胞間通訊關系,圓圈大小表示顯著性差異水平,圓圈顏色越紅表示細胞間通訊關系越強

TCGA預后聯合分析

以TCGA臨床信息以及篩選到的關鍵基因為研究對象,結合TCGA臨床數據,進行預后分析,獲得該基因/基因集與臨床預后之間的關系。

注:橫坐標表示生存期,縱坐標表示占比,不同顏色曲線代表不同分組